ÉTUDE CINÉTIQUE DE LA PHOSPHATASE ALCALINE
ET
DÉTERMINATION DU pH OPTIMUM

BUT: Connaître les caractéristiques de la phosphatase alcaline tels que la Vm, le Km et le pH optimum.

Lors de ce T.P. On étudiera donc les propriétés phosphatase et alcaline de cette enzyme.
Une phosphatase est une enzyme qui hydrolyse un monoester phosphorique et forme un phosphate et un alcool ou unphénol:
R-O-PO32- + H2O ? R-OH + HPO42-

Pour connaître le Vm et le Km de cette enzyme, on a besoin d’étudier sa cinétique: on dosera par spectrométrie les produits apparus en présence de différentes quantités de substrats connus. Et pour connaître son pH optimum on dosera, toujours par spectrométrie, les produits apparus en présence d’une quantité fixe de substrats dans différents milieuxalcalins de pH connus.

Cette enzyme est très présente dans certains tissus comme les tissus osseux, muqueuse intestinale. On utilisera donc une phosphatase alcaline de mucus intestinal de veau.

I.Étude cinétique

Lors du dosage on utilisera comme substrat le p-nitrophényl phosphate (PNPP) qui est hydrolysé par la phosphatase alcaline en p-nitrophénol (PNP) qui est jaune en milieu alcalin:le PNP a une absorbance maximum à 410 nm.

O2N- -O-PO32- + H2O ? O2N- -OH + HPO42-

La densité optique (D.O) de la solution à 410 nm est donc proportionnel à la quantité de PNP présents, donc proportionnelle à la consommation de PNPP.
On aura besoin de faire une gamme étalon à partir de quantités de PNP connues pour connaître la correspondance entre la D.O et laquantité de PNP.

On dispose comme produit de:
Tampon Tris-HCl 0,1M ph 8,3 qui permet uniquement de maintenir un pH=8,3
PNPP 5mM (185mg/100mL)
PNP 0,5mM (7mg/100mL) utilisé pour la gamme étalon
Zn Cl2 0,6mM (82mg/L) qui permet à l’enzyme d’avoir les 4 ions bivalents
phosphatase alcaline 0,1mg/mL (50unités/100mL)

N.B: Toutes les mesures et les manipulations se font à 37°C, températurephysiologique.

1.Gamme étalon

N° tube
1
2
3
4
5
6
Tampon Tris-HCl pH 8,3 0,1M
0,75 mL
0,75 mL
0,75 mL
0,75 mL
0,75 mL
0,75 mL
PNP 0,5 mM
0 mL
0,025 mL
0,05 mL
0,1 mL
0,15 mL
0,2 mL
ZnCl2 0,6 mM
0,25 mL
0,25 mL
0,25 mL
0,25 mL
0,25 mL
0,25 mL
H2O
1,0 mL
0,975 mL
0,95 mL
0,9 mL
0,85 mL
0,8 mL
Volume Total
2 mL
2 mL
2 mL
2 mL
2 mL
2 mL
[PNP]
(0 *0,5)/(2.10-3)
= 0 ?M
6,25 ?M
12,50 ?M
25,00 ?M
37,50 ?M
50,00 ?M

On règle le zéro du spectromètre avec une solution d’eau distillée.
Le tube 1 est le blanc, il permet de mesurer la pollution éventuelle due aux autres produits.

On obtient les valeurs suivantes:

N°tube
1
2
3
4
5
6
[PNP] (?M)
0
6,25
12,5
25
37,5
50
D.O lue
-0,019
0,078
0,125
0,401
0,587
0,757
D.Ocorrigée
0,000
0,078
0,125
0,401
0,587
0,757

On trace ensuite la droite D.O =f([PNP]) (voir figure 1) . On obtient une droite linéaire
D.O =a [PNP]
La loi de Beer-Lambert s’écrit D.O = ?.l.[PNP], avec ? l’absorptivité molaire, l la longueur du trajet optique dans la solution traversée. Dans notre expérience l= 1 donc a = ? .

2.Dosage du PNP par spéctromètrie

Dilutionsen cascade d’une solution de PNPP :

En premier lieu, nous avons effectué une série de dilutions en cascade afin d’obtenir des solutions de PNPP de concentrations dégressives. La solution-mère de départ de PNPP (para-nitrophényl phosphate) que nous utilisons est à 5mM. Nous réaliserons successivement une solution à 2,5mM, 1mM, 0,5mM, 0,25mM, 0,167mM et enfin 0,125mM. Nous procédons comme décritci-dessous, en pipetant une partie de la solution précédente et en ajoutant de l’eau distillée afin de former la solution suivante.
Les proportions choisies veillent à maintenir une quantité de solution comprise entre 8 et 12 mL après le pipetage pour former la solution suivante.

Nous avons calculé les quantités à pipeter de la façon suivante :

Ci .Vi=Cf.Vf donc Vi=(Cf.Vf)/Ci…